蛋白純化方法，看看有你不會(huì )的嗎
那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于蛋白純化方法，看看有你不會(huì )的嗎？
蛋白質(zhì)在組織或細胞中一般都是以復雜的混合物形式存在,每種類(lèi)型的細胞都含有上千中不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項艱巨而繁重的任務(wù),到目前為止,還沒(méi)有一個(gè)單獨的或一套現成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合物中提取出來(lái),但對任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當的分離提純程序來(lái)獲得高純度的制品。
蛋白質(zhì)提純的總目標是設法增加制品純度或比活性,對純化的要求以合理的效率、速度、收率和純度,將需要蛋白質(zhì)從細胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來(lái),同時(shí)仍保留有這種多肽的生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。
蛋白質(zhì)分離純化的一般程序可分為以下幾個(gè)步驟:
1、材料的預處理及細胞破碎分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí),首先要把蛋白質(zhì)從組織或細胞中稀釋出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài),不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有:
(1)機械破碎法這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎。常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
(2)滲透破碎法這種方法是在低滲條件下使細胞溶脹而破碎。
(3)反復凍融法生物組織經(jīng)凍結后,細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡(jiǎn)單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。
(4)超聲波法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。
(5)酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
2、蛋白質(zhì)的抽提通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來(lái)。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、triton X-100等),使膜結構破壞,利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過(guò)程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質(zhì)的變性。
3、蛋白質(zhì)粗制品的獲得選用適當的方法將所要的蛋白質(zhì)與其它雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。比較方便的有效方法是根據蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行的分離。常用的有下列幾種方法。
(1)等電點(diǎn)沉淀法不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分離。
(2)鹽析法不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過(guò)調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),并能再度溶解而不變性。
(3)有機溶劑沉淀法中性有機溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,進(jìn)而從溶液中沉淀出來(lái),因此可用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。此外,有機溶劑會(huì )破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,促使蛋白質(zhì)分子變得不穩定而析出。由于有機溶劑會(huì )使蛋白質(zhì)變性,使用該法時(shí),要注意在低溫下操作,選擇合適的有機溶劑濃度。
4、樣品的進(jìn)一步分離純化用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì),須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過(guò)濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。
有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。
5、紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。利用一定波長(cháng)下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速、不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測,因為此時(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化,而不需知道其優(yōu)良值。
此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差,干擾物質(zhì)多,在用標準曲線(xiàn)測定蛋白質(zhì)含量時(shí),對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì),有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會(huì )出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表,再進(jìn)行計算的方法,加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經(jīng)過(guò)校正,測定的結果還是存在一定的誤差。
此外,進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí),由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時(shí)的pH要與測定標準曲線(xiàn)的pH相一致。
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